UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA DISCIPLINA: Métodos Espectroscópicos de Análise Inorgânica (QUI 611) DISCENTE: Iterlandes Machado Júnior - 38771 DOCENTE: Carlos Roberto Bellato VIÇOSA 2009

Koh, J.; Kwon, Y.; Pak, Y. Separação e determinação sensível de espécies de arsênio (As3+/As5+) usando coluna imobilizada com levedura e geração de hidreto no ICP-AES, Microchemical Journal, n.80, Lake Charles, LA, USA. 2005. p.195– 199

Os compostos de arsênio foram venenos comuns usados por assassinos e suicidas desde os tempos dos antigos romanos até a idade Média. Os compostos de arsênio também foram amplamente usados como pesticidas, antes da era moderna dos compostos orgânicos. Embora seu uso tenha diminuído, a contaminação por arsênio ainda constitui um problema ambiental em algumas regiões do planeta. As fontes de arsênio para o ambiente são os pesticidas, mineração, fundição (ouro, chumbo, cobre e níquel), produção de ferro e aço, combustão de carvão. A lixiviação de minas abandonadas de ouro, de décadas e séculos atrás, continuam sendo fonte significativas de poluição por arsênio nos sistemas aquáticos. 3

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Em águas naturais, o arsênio está presente principalmente na forma de compostos inorgânicos, onde possui as valências 3+ e 5+. A toxicidade das diversas espécies de arsênio decresce na seguinte ordem: compostos de As3+ inorgânico > compostos de As5+ inorgânico > compostos de As3+orgânico> compostos de As5+ orgânico. Em termos de intensidade, o As3+ inorgânico é 60 vezes mais tóxico que o As5+ inorgânico.   5

O Caso de Bangladesh “O mundo passou a prestar mais atenção a tal risco de contaminação após a constatação de que os poços de água de 59 distritos de Bangladesh continham altos níveis de arsênio. Isso corresponde a 85% da área total do país, com risco potencial para 75 milhões de habitantes. Pelo menos 1,2 milhão de pessoas já apresentaram sinais de intoxicação. O problema foi constatado pela primeira vez em 1993 e confirmado em 1995, quando se verificou que a área atingida era muito maior do que a inicialmente estimada. Além de Bangladesh, há registro de ocorrência de larga escala em Gana, Taiwan, no norte da China, Hungria, Grécia, Áustria, México, Chile, Argentina e Estados Unidos”. Liana John - <www.estadao.com.br/ciencia/aplicada/2003/fev/19/315.htm> 6

Em 1993, a OMS modificou, provisoriamente, o valor máximo permissível de 50 para 10 μg L-1 de As em água para consumo humano A União Européia vem adotando o valor de 10 μg L‑1, ou mais baixos. Muitos outros países, como Bangladesh, mantêm o limite de 50 μg L-1 A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos, em 2001, reduziu de 50 para 10 μg L-1 No Brasil, a portaria do Ministério da Saúde nº 518, de 25 de março de 2004, que normaliza a Qualidade de Água para Consumo Humano, tem o valor de 10 μg L-1 de As como o máximo permitido. Dentre dessa recente preocupação com os teores de As nas águas brasileiras, o Conselho Nacional de Meio Ambiente, órgão vinculado ao Ministério do Meio Ambiente, recentemente revisou na resolução nº 357/05 os teores desse elemento para as águas de rio (Classe 1 e 2), reduzindo de 50 para 10 μg L-1 7

O sintoma de envenenamento por arsênio aparece como conjuntivite, melanose, despigmentação e queratose (feridas). São também relacionados ao arsênio tumores na bexiga, fígado, pulmões e rins. Os casos melhor documentados de envenenamento estão na Índia, Bangladesh, Taiwan, China, México e Chile. A ingestão de apenas 100 mg de trióxido de arsênio (As2O3) é capaz de ser letal a uma pessoa. 8

Tem sido desenvolvida uma variedade de tecnologias para remoção de arsênio em águas, que incluem: troca iônica, alumina ativada, osmose reversa, coagulação/filtração, eletrólise reversa e oxidação/filtração. Estes processos de remoção de arsênio geralmente envolvem um pré-tratamento de oxidação do As(III), seguido pela adsorção ou coprecipitação do As(V) formado usando adsorventes ou coagulantes (Mendes et al., 2009); Uma espécie de samambaia é capaz de absorver arsênico - um metal altamente tóxico e cancerígeno, que contamina o solo e água, podendo até matar. Esta samambaia, cujo nome científico é Pteris vittata, é originária da África, mas ocorre no mundo todo, inclusive no Brasil. Ela é o que os cientistas chamam de "hiperacumulador" e concentra em sua folhagem até 126 vezes mais arsênico do que a quantidade encontrada no solo. Msc.Décio Escobar Oliveira Ladislau – <http://mundoorgnico.blogspot.com/2009/09/samambaia-africana-retira-arsenico-de.html> 9 Samambaia africana: Pteris vittata

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12 Vt = volume total (ocupado pelo gel + solvente) V0 = volume da fase móvel Vt-V0 = volume do gel

Micrografia eletrônica da levedura Saccharomyces cerevisiae imobilizada em CGP

Espectrometria de Emissão Atômica (Atomic Emission Espectrometry – AES); Quando átomos são excitados na chama  retornam ao estado de menor energia  emitem linhas espectrais (energia) que podem ser utilizadas na análise quantitativa e qualitativa do elemento. 14 E Excitação Emissão Íon no estado excitado Íon no estado fundamental Estado fundamental 3 2 1

Plasma  É uma mistura gasosa condutora de eletricidade, que contém uma concentração significativa de cátions e elétrons; Espectrometria de emissão atômica por plasma indutivamente acoplado (ICP-AES): corresponde a produção de um espectro pela nebulização da amostra no interior de um plasma de argônio. Este plasma foi ionizado por um campo magnético gerado por uma bobina de radiofreqüência; Componentes principais: Sistema de introdução de amostra: geralmente formado por um nebulizador-câmara de nebulização, tocha de quartzo (geração do plasma) e uma fonte de radiofrequência; Sistema óptico: para permitir a eficiente separação dos diferentes comprimentos de onda; Sistema de detecção: fotomultiplicadores e detectores de estado sólido; Sistema computacional. 15

16 Policromador Rowland Policromador Echelle

VANTAGENS: Técnica multielementar e com uma faixa de concentração mais ampla; Análises simultâneas ou análises seqüenciais rápidas; Sensibilidade aumentada, principalmente para elementos nos quais falham a AAS (Be, B, P, Ge, Nb, Sn, La, Hf, W, U); Faixa linear de trabalho: 0,1-1000 µg/mL. A faixa de trabalho dos instrumentos de AAS é normalmente de 1-10 µg/mL; Métodos de vaporização permitem a medida rápida de muitas amostras sólidas. LIMITAÇÕES: Alto custo operacional; 1 m3 de argônio para cada hora de operação. 17

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A introdução de hidretos de metais diretamente no plasma permite análise de alta sensibilidade. A geração de um hidreto metálico é obtida usualmente através da reação de hidreto de boro e sódio com ácido clorídrico, conforme exemplo a seguir: 19 3 NaBH4 + 3 HCl + 4 H3AsO3  3 H3BO3 + 4 AsH3  + 3 H2O + 3 NaCl

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Sem perda de analito, decorrente da reação rápida e completa entre metal e hidreto gerado in situ; Máxima eficiência de transporte do hidreto de metal formado, uma vez que este se apresenta na forma gasosa; Facilidade de separação do analito desejado; Redução do limite de detecção, tipicamente de 5 a 30 vezes, comparado ao método usual; Possibilidade de especiação química, para estados de oxidação com maior cinética de reação; Sistema automatizado, mantendo constante as condições operacionais de análise, ponto crítico da técnica de geração de vapor químico associado a ICP-AES; Eficiência do processo de atomização e excitação, uma vez que processos concorrentes, como dessolvatação e vaporização, comuns ao sistema de nebulização de amostras líquidas pelo modo pneumático, são evitados. 21

Desenvolver uma coluna com fermento imobilizado e usá-la na determinação de espécies de arsênio em processo on-line de HVG-ICP-AES. 22

INSTRUMENTAÇÃO ICP-AES (Perkin-Elmer 1000, Norwalk, CT, E.U.A.) (ver imagem); Bomba de cromatografia em fase gasosa (Analytical P2000, Spectra-Physics, Analytical, CA); Gerador de hidreto foi comprado da Perkin-Elmer, com separador de membrana (porosidade comprimento = 1,0 µm,  = 10 mm); Válvula de injeção de seis vias; Tubo de politetrafluoretileno (PTFE) com diâmetro interno do de 0,8 mm; Coluna de enchimento (4,7 cm de comprimento x 0,45 centímetros diâmetro), que é normalmente usada como uma pré-coluna em HPLC (ver imagem). REAGENTES Água deionizada, resistividade: 18,2 MΩcm; Ácido inorgânico (HCl, HNO3, H2SO4); As2O3 para preparo de As3+; Na2HAsO4.7H2O para preparo de As5+; NaBH4 (extra puro 98%) comprado de Junsei Chemicals (Osaka, Japão) e preparado entes do experimento; Herbicida (40% metolacloro); Pesticidas (Diclorvos); Cigarro (This); Materiais de referência geológicos como o NIST SRM 2710 (solo de Montana) e 1566b (tecido de ostra); CPG (120-200 mesh, 239 Å) e sílica gel (100-200 mesh, 150 Å, classe 644) adquiridos pela empresa Sigma (St. Louis, MO); Levedura (Saccharomyces cerevisiae ). 23

24 P2000 HPLC PUMP

25 ICP-AES MODELO PERKIN-ELMER 1000

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27 Os padrões de arsênio foram compradas em lojas locais; A concentração final foi ajustada para a ordem de µg g-1.

28 Herbicida (40% metolacloro), pesticidas (Diclorvos) e cigarro (This) foram cuidadosamente preparados de acordo com a literatura para a análise. F.N. Abercrombie, M.D. Silverster, R. Curz, Ultratrace Metal Analysis in Biological Sciences and Environment, Adv. Chem. Ser., vol. 172, American Chemical Society, 1979, p. 10. A concentração final foi ajustada para a ordem de µg g-1.

29 Condições otimizadas estabelecidas para o ICP

30 Todas as condições experimentais para a eluição do reagente, a vazão e o pH foram os mesmos.

31 O pH foi controlado usando NaHCO3/Na2CO3, ácido forte e tampão de ácido acético/acetato.

32 A eluição com ambos HNO3 e H2SO4 demonstrou ser completa, mas a precisão era maior para o ácido nítrico.

33 Verificou-se que a concentração é mais importante do que o tipo de ácido empregado. Embora o sinal foi aumentando com a concentração, a estabilidade diminui.

34 Uma concentração de 3,0 mol L-1 para o ácido nítrico foi satisfatória tanto para a eluição quanto para a geração de arsina.

35 Injeção de 0,3 mL da amostra tamponada com NaHCO3/Na2CO3 em pH 7 Solução de HNO3 3,0 mol.L-1 2,0 % HAsO4-2 H3AsO3 (1º) Determina-se As(III) HNO3 3,0 mol.L-1 (2º) Determina-se As(V)

36 Era esperado que As3+ fosse mais fortemente ligado ao grupo -SH de proteínas da célula do que As5+. Pensa-se que os sítios de ligação foram bloqueados durante o processo de imobilização da levedura em CPG.

37 Para cada uma das espécies de arsênio, as curvas de calibração (Fig. 7a e b) foram obtidas para a concentração de aproximadamente 0.1-1,0 µg g-1 utilizando levedura imobilizada em coluna HG-ICP. Ambas as curvas mostram boa linearidade (r2 = 0,9997) para o intervalo estudado.

38 Para testar a validade da técnica, NIST SRMs foram empregadas.

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40 Tem sido demonstrado com sucesso que o fermento Saccharomyces cerevisiae é capaz de imobilizar, seletivamente, As5+ e As3+ na coluna de fracionamento por Cromatografia de Permeação em Gel (CPG). Pela seleção adequada de pH, As5+ é retida na coluna mais eluída com ácido nítrico. Combinado com a geração de hidreto após a coluna, a sensibilidade é aumentada consideravelmente. Arsênios inorgânicos podem ser sensivelmente determinados continuamente com o método on-line. Materiais de referência geológicos (SMRs) e amostras naturais foram analisados, obtendo-se resultados precisos para a determinação de espécies de arsênio inorgânico.

Jitmanee, K.; Oshima, M.; Motomizu, S. Especiação de arsênio (III) e arsênio (V) por espectroscopia de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado em sistema de pré-concentração, Talanta, n.66, Seattle WA, USA, 2005. p. 529–533

A contaminação da água por arsênico é muito problema grave em alguns países, como Bangladesh e Índia, onde uma grande parte da população está exposta a elevados riscos para a saúde pelo consumo de água potável contaminada com arsênio. Conseqüentemente, um método de especiação, sensível e seletivo torna-se necessário para as análises de arsênio. Métodos bem estabelecidos incluem o acoplamento de técnicas de separação, tais como IC, HPLC e HVG, para a separação de espécies de arsênio com sistemas de detecção para elementos específicos, por exemplo, ICP-MS, HG-AFS, etc. A maioria dos métodos apresentados até agora têm utilizado a diferença entre as concentrações de arsênio total ((III) ou (V)) e a concentração de As(III) ou As(V). Em águas naturais, no entanto, a concentração de As (V) é muito superior que a concentração de As(III), que é mais importante e mais tóxico que o primeiro. 42

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Desenvolver um sistema simples para especiação de As3+/As+5 sobre uma fase sólida, com base na diferença nas constantes de dissociação ácida, através de um sistema on-line seguido da quantificação por ICP-AES. 44

INSTRUMENTAÇÃO 45 REAGENTES ICP-AES (Vista Pro, Seiko Instrument & Varian Instrument) (ver imagem); Tubo de politetrafluoretileno (PTFE) (0.5mm ) utilizado para a montagem das linhas de fluxo de injeção (ver imagem). Bomba de duplo pistão (P3) (F.I.A Instruments, Tóquio, Japão) usada para bombear a solução eluente; Bombas peristálticas (P1 e P2) (ALITEA, Suécia) utilizadas para a propulsão do acetato de amônio; Sistema de Ultrapurificação de Água Milli-Q (ver imagem). Água deionizada, resistividade: 18,2 MΩcm-1; Ácido nítrico (reagente ultrapuro: Kanto Chemical Co., Japão) Meta-arsenito de sódio (NaAsO2) para preparo de As3+ (Wako Pure Chemical Industries, Japão); Na2HAsO4.7H2O para preparo de As5+ (Kanto Chemical Co., Japão); KMnO4 (Ishizu Farmacêutica Co., Japão); Ácido acético (qualidade eletrônica: Mitsubishi Chemicals, Japão); Amônia (29%, qualidade eletrônica: Mitsubishi Chemicals, Japão). Resina de troca iônica Muromac® 2×8, 100-200 mesh, na forma de Cl- (Muromachi Technos Co., Japão);

46 ICP-AES MODELO VISTA PRO, SEIKO INSTRUMENT & VARIAN INSTRUMENT

47 SISTEMA DE ULTRAPURIFICAÇÃO DE ÁGUA MILLI-Q

48 TUBOS E CONEXÕES DE POLITETRAFLUORETILENO (PTFE)

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50 Axial - visão direta no plasma, maior sensibilidade, ideal para faixa de detecção mais baixa. Radial - vista lateral tradicional, ideal para as amostras mais concentradas. Radial Axial

51 Gerador de freqüência RF = 40 MHz; Potência do plasma = 1.10kW; Fluxo de gás no plasma (Ar) = 15 L min-1; Fluxo de gás auxiliar (Ar) = 1,5 L min-1; Nebulizador de fluxo de gás (Ar) = 0,75 L min-1; Câmara de nebulização tipo ciclônica de vidro; Nebulizador concêntrico de vidro ou quartzo (tipo K); Tocha axial de baixo fluxo;

52 Tempo de varredura correspondente à linha de emissão de 188,980 nm.

53 1000 mg L-1 de Meta-arsenito de sódio (NaAsO2) para preparo de As3+ Na2HAsO4.7H2O para preparo de As5+ Água ultra-purificada A solução de permanganato de potássio (reagente de qualidade analítica: Ishizu Farmacêutica Co., Japão) foi preparada pela dissolução de quantidades conhecidas em água. O tampão amônia/acetato de amônio preparado pela mistura adequada de ácido acético (qualidade eletrônica: Mitsubishi Chemicals, Japão) e amônia (29%, qualidade eletrônica: Mitsubishi Chemicals, Japão). Ácido nítrico (reagente ultrapuro: Kanto Chemical Co., Japão) foi usado como eluente após uma diluição com água.

54 A unidade de coleta/concentração em fase sólida (UC) foi preparada empacotando a resina trocadora de ânions num tubo de politetrafluoretileno, PTFE (2 mm  × 5 cm) selado com lã de vidro (empacotamento para cromatografia gasosa, Kishida Chemical Co., Japão) em ambas as extremidades do tubo para manter a resina na unidade. Um tubo menor de PTFE (0.5mm ) foi fortemente inserida nas extremidades da unidade de concentração, o que permitiu ser colocada na válvula de 6 vias .

55 As espécies de arsênio podem ser separadas selecionando o pH das amostras que devem ser abaixo do valor do primeiro pKa de As(III), pKa1 = 9,2. Sob tal condição, como uma espécie não-iônica e não pode ser retida na resina de troca iônica utilizada, enquanto que As(V) está presente como uma espécie aniônica e pode ser coletado. A amostra contendo As(III) e As(V) em pH de 4-7 foi analisada. A concentração de permanganato de potássio e As(III) usados neste estudo foi de 1,10-6 mol.L-1 e 0,27.10-6 mol.L-1 (20 µg.L-1), respectivamente. Verificou-se que o aumento do pH 4 para 6 levou a um aumento dos sinais de As (III), e no intervalo de pH de 6 a 7, os sinais permaneceram constante. Assim, o pH 6,3 da amostra foi adotado para estudos posteriores. Efeito do pH na coleta/concentração de arsênio

56 Efeito da concentração de permanganato de potássio sobre a coleta/concentração de arsênio Os resultados demonstram que o aumento nas concentrações de permanganato de potássio de 0,1.10-6 mol.L-1 a 0,5. 10-6 mol.L-1 resultou em um aumento na intensidade dos sinais de As (III), e o aumento nas concentrações de KMnO4 de 1.10-6 mol.L-1 e 5.10-6 mol.L-1 resultou numa diminuição gradual dos sinais de As(III). Portanto, 1.10-6 mol.L-1 foi selecionado como a ótima concentração de KMnO4.

57 Efeito do comprimento da bobina de reação de oxidação do As (III) para As (V) Foi avaliado o efeito do comprimento da bobina de reação (20 cm  x 10 m) sobre a oxidação de As(III) para As(V), usando 1.10-6 mol.L-1 KMnO4 com uma vazão de 0,4 mL.min-1 e amostra de 1,0 mL.min-1. A oxidação de As(III) para As(V) foi eficaz apesar de usar pouco tempo de reação. Além disso, os sinais analíticos (alturas do pico) para o As(III) permaneceu praticamente constante, quando a bobina de reação foi aumentada para 10 m. Assim, o comprimento da bobina de reação de 20 cm foi selecionado em relação ao tempo de análise com menor consumo de permanganato.

58 Efeito da vazão de permanganato de potássio solução para a coleta/concentração de As (III) A vazão da solução de permanganato de potássio no intervalo de 0,1 - 0,8 mL.min-1 foi avaliada. A vazão de 0,2 mL.min-1 resultou nos maiores sinais de As(III) e foi suficiente para a oxidação de As(III) (0,27.10-6 mol.L-1). Aumentar a vazão para até 0,8 mL.min-1 não afetou os sinais para análise de As(III). A vazão de 0,4 mL.min-1 foi, portanto, selecionada.

59 Efeito do tamanho e vazão da amostra no sinais analíticos Os resultados mostraram que os sinais da análise de ambas as espécies aumentaram linearmente com o aumento no tamanho da amostra, pelo menos até 20 mL. Devido à contra-pressão gerada em duas unidades de concentração (UC), a vazão máxima de amostra que pode ser aplicada ao sistema foi de 3 mL.min-1. No presente estudo, entretanto, a vazão de 2 mL.min-1 foi empregado a fim de evitar qualquer perda de amostra. Sob tais condições, o efeito da concentração de permanganato de potássio foi reexaminado. A concentração de permanganato de potássio na ordem de 1.10-6 mol.L-1 a 4.10-6 mol.L-1 foi eficaz para a oxidação e coleta de 0,27.10-6 mol.L-1 de As(III). Portanto, 2.10-6 mol.L-1 de permanganato de potássio foi selecionado.

60 Condições ideais e figuras de mérito para o sistema proposto O equipamento convencional utilizado neste trabalho (ICP-AES) tem um limite de detecção de 10 µg.L-1 de As. Este limite de detecção para As (III) e As (V) foi melhorada para cerca de duas ordens de grandeza.

61 Para a coleta/concentração on line de As(III) e As(V), as etapas de funcionamento do sistema proposto (Fig. 1) são apresentados na Tabela 1, brevemente, o processo envolve a etapa de condicionamento em que a resina trocadora de ânions na unidade de concentração (UC) foi lavada com um tampão de acetato de amônia/amônio, seguido pela etapa de coleta, onde os analitos foram recolhidos na UC.

62 pH 6,3 H2AsO4- H3AsO3 H3AsO4 H2AsO4- 1º) Determina-se As(III) na forma de As(V) 2º) Determina-se As(V)

63 Análises de amostras de água doce através do método proposto As curvas de calibração usando a área máxima e altura máxima, respectivamente, para amostra de 20 mL na faixa de 0,5-20 µg.L-1 foram, Y = 2543x + 177, r2 = 0,9999 e Y = 210x + 18, r2 = 0,9999 para As(III), enquanto Y = 2456X + 1325, r2 = 0,9988 e Y = 234x + 122, r2 = 0,9983 foram para As (V), respectivamente. No entanto, somente as curvas de calibração plotadas usando altura do pico foram utilizadas para a análise quantitativa por causa da simplicidade e melhor reprodutibilidade.

64 O fluxo criado para a determinação simultânea de As(III) e As(V) foi estabelecida. Permanganato de potássio foi um agente eficiente para a oxidação de As (III) para As (V). A rápida reação de oxidação de As(III) com permanganato de potássio permite a criação do sistema de modo simplificado. O sistema proposto prevê ainda uma linha de separação de As(III) e As(V) e pré-concentração de ambas as espécies podendo ser determinados simultaneamente em uma única análise. A sensibilidade de detecção para As (III) e As (V) foi melhorada para cerca de duas ordens de grandeza em relação aos métodos convencionais de determinação por ICP-AES. Como uma vantagem sobre outras técnicas de determinação de As, o método desenvolvido pode ser utilizado para a determinação sensível de As(III) e As(V) sem acoplamento com técnicas bem conhecidas de geração de hidreto.

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