Curso “Ultimas investigaciones en Biología: células madre y embrionarias” Universidad Internacional Menéndez Pelayo Santander (8-12 Septiembre 2003) Factores epigenéticos en el desarrollo de los organismos por José Fernández Piqueras Catedrático de Genética Universidad Autónoma de Madrid

Índice 1.- Concepto de Epigenética. 2.-Mecanismos moleculares: modificaciones de DNA e histonas y remodelación de la cromatina. 3.- Cambios epigenéticos durante la gametogenésis y la embriogénesis. 4.- Ejemplos de control epigenético durante el desarrollo. 4a.- Mantenimiento de linajes celulares y otros ejemplos. 4b.- Mecanismos de compensación de la dosis génica. 4c.- “Imprinting” autosómico. 4d.- Interferencia por RNA (RNAi), heterocromatinización y eliminación cromosómica. 5.- Reprogramación de los núcleos somáticos. 6.- Epigenética y factores ambientales. 7.- Epigenética y cáncer.

1.- Concepto de Epigenética En su acepción más reciente : la parte de la Genética que estudia los cambios “heredables”en la expresión génica (se transmiten a lo largo de las divisiones celulares o incluso de una generación a otra), que no se deben a modificaciones en la secuencia de bases de su DNA sino a alteraciones químicas del DNA (metilación), de las histonas (particularmente metilaciones, deacetilaciones y fosforilaciones) y las consiguientes remodelaciones en la configuración de la cromatina (Fernández-Piqueras et al., 2002).

El término “Epigenética” fue propuesto por Aristóteles como alternativa frente a las teorías “preformacionistas” de Demócrito y Leucipo En el siglo XVII William Harvey y Casper Wolf retomaron el término “epigénesis” para referirse a los mecanismos misteriosos que permitían la aparición de nuevas estructuras durante el desarrollo embrionario que no estaban presentes en el momento de la fecundación En 1942 Waddington propuso su hipótesis “epigenética”, por primera vez en términos de control de expresión genética, para referirse a los cambios que se habían de producir en los patrones de expresión genética durante el desarrollo para explicar la formación de distintos tipos de células y tejidos a partir del zigoto Por consiguiente, el concepto actual (introducido por Wu y Morris) representa una restricción aún mayor al referirse sólo a los cambios estables (heredables clonalmente) que operan a través de cambios en la configuración de la cromatina

2.-Mecanismos moleculares: modificaciones de DNA e histonas y remodelación de la cromatina. Los programas epigenéticos de desarrollo se fundamentan en: -modificaciones del DNA (metilación) -y modificaciones de las histonas (metilaciones, acetilaciones/deacetilaciones, fosforilaciones y ubiquitilaciones) -la remodelización de la cromatina (complejos enzimáticos remodeladores dependientes de ATP)

La metilación del genoma humano: .Restringida al carbono 5 de la CITOSINA en sitios CpG (sobre todo) . La 5mC es inestable y se puede desaminar espontáneamente hacia Timina (T) hay menos sitios CpG de los teóricos. .La metilación en regiones promotoras de los genes está relacionada con la falta de expresión transcripcional (inactivación)

Sin embargo, hay unas 29.000 “Islas CpG” no metiladas en las regiones promotoras de los genes “house-keeping” que garantizan de manera permanente la configuración potencialmente “activa” de estos genes.

Pero los fundamentos moleculares de los cambios epigenéticos no se reducen a la metilación del DNA. Hay también modificaciones de las histonas. En 1993 Wolffe demostró que los procesos de acetilación/deacetilación de las “colas” de histonas en aminoácidos específicos estaban relacionados con el control de la expresión génica a través de sus interacciones con otras proteínas reguladoras En 1998 Adrian Bird demostró que las deacetilasas de histonas actuaban en conjunción con las metilasas de DNA Finalmente, en 2001, Tony Konzarides demostró que la metilación de la histona H3 atrae otras proteínas (como la HP1) para crear una configuración inactiva de la cromatina. Hoy se habla de un “código de histonas” que estaría superpuesto de alguna manera al “código genético” de tripletas del DNA

Li (2002 3: 662) Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development Nat Rev Genet

Li (2002 3: 662) Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development Nat Rev Genet -Mutaciones en Dnmt3b causan síndrome ICF IInmunodeficiencia inestabilidad centromérica-anomalías faciales) por la hipometilación regiones centroméricas. -Mutaciones en MECP2: síndrome de Rett -Hipermetilación región promotora FMR1 y síndrome X fragil

Estadios jerarquizados en la organización de la cromatina.- Los estadios de mayor estabilidad/probabilidad estarían en los extremos. H3, histona H3. K, lisina.*. La metilación del DNA no es un mecanismo universal Deacetilación H3K9 Represores transcripcionales Activadores transcripcionales cromatina abierta/activa cromatina condensada/inactiva mayor probabilidad/estabilidad Acetilación H3K9 Feed-back - Metil-H3K4 Metilación H3K9 Metilación CpG* Feed-back + Proteínas remodeladoras Memoria celular

Park & Pfeifer (2003) Epigenetic interplay Nat Genet 34: 126

Los genomas materno y paterno no son equivalentes 1.- Diploidía uniparental inducida mediante transplante nuclear en el ratón: .Ginogenotes: media gestación y deficiencias en tejidos extraembrionarios .Androgenotes: estructuras embrionarias severamente afectadas. 2.- Diploidía uniparental espontánea en la especie humana: .Ginogenotes: quistes dermoides que derivan en teratomas ováricos; no estructuras extraembrionarias. .Androgenotes: molas hidatiformes de vellosidades coriónicas y otras estructuras placentarias. 3.- Disomías uniparentales espontáneas en la especie humana .Dos copias paternas del cromosoma 15: síndrome de Angelman .Dos copias maternas: síndrome de Prader-Willi 3.- Cambios epigenéticos durante la gametogenésis y la embriogénesis (i).

Regulaciones epigenéticas durante la gametogénesis 3.- Cambios epigenéticos durante la gametogenésis y la embriogénesis (ii).

Regulaciones epigenéticas durante la embriogénesis 3.- Cambios epigenéticos durante la gametogenésis y la embriogénesis (iii).

4.- Ejemplos de control epigenético durante el desarrollo. 4a.- Mantenimiento de linajes celulares y otros ejemplos -Fisher AG (2002) Cellular identity and lineage choice. Nat Rev Immunol 2 (december): decisiones durante la diferenciación de células del sistema hematopoyético de mamíferos. Polycomb -En Drosophila: las proteínas de los grupos Polycomb y trithorax mantienen los patrones de expresión de los genes Hox inducidos inicialmente por los genes de segmentación (Simon & Tamkun, 2002) -Mantenimeinto de una ratio de genes RNAr activos y dominancia nucleolar (Grummt & Pikaard, 2003)

Inactivación del cromosoma X en la línea somática de hembras de mamíferos (1). a, genes que se inactivan (rojo) y otros que escapan de la inactivación (verde). b, mecanismo de recuento. c, el carácter aleatorio puede traducirse en mosaicismo genético. 46XY; 45 XO 46XX; 47XXY 47XXX; 48 XXXY 48XXXX; 49XXXXY b A a A a A a A a A a A a Células que expresan A Células que expresan a Mosaicismo genético c G6PD HPRT GLA RPS4X, PGK2, XIST UBE1, TIMP1, SB1.8, UTX, SMCX/XE 169X, ZXDA, ZXDB OTC, CYBB ZFX, PHHA1, POLA, EIF2 GSIX, STS, KAL1 PGLPL,SOHX, ANT3,MIC2,XG a PAR2: SYBL1, IL9R 4b.- Mecanismos de compensación de la dosis génica.

Inactivación del cromosoma X en la línea somática de hembras de mamíferos (2). mecanismo molecular de la inactivación. Después seguirían metilación H3/K9 (Ezh2), deacetilación H3, metilación islas CpG genes inactivados, e introducción de macroH2A. Xce/Potenciador? Xist Tsix Xq13 Xce/Potenciador? Xist Tsix Xq13 X inactivo CTCF X activo

Lee (2003) Molecular links between X-inactivation and autosomas imprinting: X-inactivation as a driving force for the evolution imprinting. Current Biol 13: 242-254 Se conocen más de 50 genes en el genoma del ratón afectados por el “imprinting” 4c.- “Imprinting” autosómico

The Beckwith- Wiedemann cluster (1 Mb) The Prader -Willi/ Angelman cluster (2 Mb) Reik & Walter (2001) Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nat Rev Genet 2 (January) Red, maternally expressed, Blue, paternally expressed, Black, biallelic expression, Green, not known or not precisely defined, IC, impimting centers.

Igf2 H19 Potenciador Igf2 H19 Potenciador Cromosoma materno Cromosoma paterno 11p15.5 11p15.5 Región del cromosoma 11 humano afectada por un fenómeno de “imprinting”: organización en “clusters” recíprocos, que contienen a su vez genes de RNAs no codificantes. CTCF DMR/ICR DMR/ICR RNA no codificante RNA antisentido

7mG 4d.- Interferencia por RNA (RNAi), heterocromatinización y eliminación cromosómica

Matzke & Matzke (2003) RNAi extends its reach. Science 301: 1060

Schramke & Allshire (2003) Science 301: 1069

La RNAi, un auténtico sistema inmune frente a las invasiones virales, los elementos transponibles, transgenes e, incluso, RNAs “mal expresados” Plasterk (2002) Science 296: 1263

RNAi to the rescue? By Erika Check, Nature 4 Sep 2003

Los problemas epigenéticos de los clones obtenidos por transferencia nuclear a partir de células adultas diferenciadas. ¿Porqué el bajo rendimiento de la técnica?. ¿Envejeció prematuramente Dolly? 5.- Reprogramación de los núcleos somáticos.

Li (2002 3: 662) Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development Nat Rev Genet

6.- Epigenética y factores ambientales 1.- Vernalización en plantas (FLC metilado/no metilado con altitud y expresión del gen del grupo Polycomb VRN2) 2.- Cambios en patrones de metilación con la edad: hipometilación global e hiper-metilaciones específicas (receptor de estrógenos, IGF2, MYOD etc.)¿dif. entre gemelos idénticos? ¿expresividad variable y penetrancia incompleta en enfermedades neurológicas?. 3.- Influencia dieta rica en folatos: datos epidemiológicos en la especie humana y ejemplos experimental es en el ratón (enfermedades neurológicas y cáncer de colon).

Robertson & Wolffe (2000) DNA methylation in health and disease Nat Rev Genet 1:11

Nature February 2003

Jaenish & Bird (2003) Epigenetic regulation of gene expression. Nat Genet 33: 245 Evidencia experimental de la influencia de la dieta en los mecanismos epigenéticos ..pero ratas embarazadas alimentadas con dieta rica en folatos: mayoría descendencia agutí-normal

Durante el desarrollo de un cáncer se suele producir: 1.- “Demetilación global del genoma” 2.- Aumento en la actividad 5metil-transferasa 3.- Hipermetilación de las islas CpG en promotores de genes supresores específicos 7.- Epigenética y cáncer

Jones & Baylin (2002) The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet 3 (June) Consecuencias genéticas de la hipermetilación en el cáncer

Verde, sólo mutaciones génicas Rojo, sólo hipermetilación Morado, mut y/o hipermetilación ATM, ataxia telangiectasia mutated APC, adenomatosis polyposis coli BRCA1/2, breast cancer CDH1, E-cadherin CDKN2A/B, p16 y p15 INK4 FHIT, fragile histidine triad GSTP1, glutathione S-transferase MLH1, Mut L homologue 1 MSH2, Mut S homologue 2 NF1/2, neurofibromin PTCH, patched homologue PTEN, phosphatase and tensin homologue RB1, retinoblastoma SMAD4, mothers againstdecapentaplegic homologue 4 SMARCA3/B1, SWI/SFN related… STK11, serine/threonine kinase 11 TIMP3, tissue inhibitor of metalloproteinase VHL, von Hippel-Lindau syndrome

Inactivación de un gen supresor humano por hipermetilación de las islas CpG de sus promotores (a, forma activa; b, inactiva). A, activadores; CA, coactivadores; DNMTs, DNA metil -transferasas; MBP, proteína de unión a DNA metilado; HA, acetilasas de histonas; HDCA, deacetilasa de histonas; HMT, metilasas de histonas; FTs, factores de transcripción basales; R, represores; CR, correpresores; CTCF y GCF2, proteínas de unión a otros elementos reguladores. Pro, promotor. Exon 1 transposón Exon 2 Aislante Potenciador Pro on DNMTs Exon 1 transposón Exon 2 Aislante Potenciador Pro CTCF DNMTs transcripción a b off HMT

Silenciamiento genético Silenciamiento epigenético Tumor heterogeneity Interesting in metástasis? E-cadherin? Tumor homogeneity

De novo methylation of CpG during aging 5 aza 2´deoxyazacytidine or procanamide Epithelial cells Early detection

Nuevas formas de terapia basadas en los procesos epigénéticos: agentes demetilantes, inhibidores de enzimas reparadoras de metilación, inhibidores de deacetilasas etc.

HP1 ….to be continued