Podemos dizer que a citogenética molecular se refere ao conjunto de técnicas e do conhecimento resultante da sua aplicação, que fazem a ligação entre o microscópio e a sequência de DNA.

Na citogenética humana temos uma sobreposição entre pesquisa básica e a aplicação clínica e as técnicas laboratoriais foram e ainda são as principais responsáveis pela grande evolução do mapeamento do genoma e repercussões clínicas.

A descoberta de que temos 46 cromossomos tem pouco mais de 50 anos e essa conclusão foi possível a partir do desenvolvimento de técnicas como o uso da fitohemaglutinina para estimular o crescimento de linfócitos em cultura, do choque hipotônico usado nas preparações cromossômicas permitindo uma melhor visualização e do uso da colchicina que interferindo no mecanismo de divisão celular aumentava o número de células em metáfase nas culturas.

Assim, a década de 60, quando foram descritas as anomalias cromossômicas associadas às S. de Down, Edwards, Patau, Turner, Klinefelter, duplo Y, pode ser chamada de a década das trissomias. Começaram também os estudos citogenéticos populacionais, tanto em recém-nascidos consecutivos como em grupos de popilações selecionadas por apresentarem retardo mental, atraso no desenvolvimento, esterilidade ou infertilidade ou até distúrbios de comportamento. Desde então, tem-se trabalhado para se estabelecer uma correlação cariótipo-fenótipo, localização ou mapeamento de genes e, consequentemente uma correlação genótipo-fenótipo. Podemos dizer que nessa época nasce a citogenética clínica.

Nos anos 70 apareceram as primeiras tentativas para se identificar segmentos cromossômicos na espécie humana com as técnicas de bandeamento que, conforme foi visto na aula anterior, permitiram identificar inúmeras anomalias cromossômicas.

E nos anos 80, as técnicas de alta resolução permitiram que visualizassemos alterações em segmentos menores

Revelando as síndromes dos genes contíguos como Miller-Diker, Wilms-Aniridia, Williams, Prader-Willi e Angelman, Retinoblastoma, DiGeorge. (Não vou falar sobre essas sindromes porque esse não é o objetivo dessa aula. Eu poderia até escolher uma delas e mostrar pra voces todas as técnicas citogenéticas e moleculares envolvidas desde a sua descrição até o que se sabe hoje, mas acho que isso daria um curso inteiro).

Mas os citogeneticistas queriam enxergar mais. Ja em 1969, o classico trabalho de Pardue e Gall mostra o uso de sondas radioativas de sequencias altamente repetitivas de DNA hibridando com regióes centromericas de cromossomos de camundongo.

Na década de 80 as técnicas de hibridação in situ começaram a ser utilizadas em preparações citogenéticas usando, inicialmente sondas radioativas. Harper et al conseguiram localizar o gene da insulina no braço curto do cromossomo 11.

Pouco depois vieram as sondas não isotópicas, ie, não radioativas, marcadas com biotina e prata.

Essas técnicas eram muito demoradas. Havia o processo de marcação, depois as lâminas eram cobertas com um filme, ficavam em um recipiente longe da luz por horas ou dias e, posteriormente, eram reveladas. As lâminas eram observadas ao microscópio e os genes eram mapeados nos locais onde havia um maior número de pontos.

Em 1986 foi relatado o primeiro trabalho usando sondas fluorescentes (Pinkel et al, 1986).

Durante esses últimos anos vimos o desenvolvimento e implementação de técnicas de hibridação in situ com sondas fluorescentes como o FISH, SKY, M-FISH, R-FISH, Fiber-FISH, CGH e Array-CGH. A aplicação dessas técnicas na genética clínica nos trouxe algumas respostas quanto a identificação de rearranjos complexos, microdeleções e mapeamento gênico. Por outro lado trouxe novas questões tanto quanti ao funcionamento dos genes quanto o a correlação genótipo-fenótipo.

Vamos ver um pouco dessas técnicas e suas aplicações, entender o que o laboratório faz, as possibilidades, limites de cada procedimento, como solicitar um exame, como interpretar um resultado, etc

Lembrando ainda que na clinica essas tecnicas ainda sao usadas como complementares ao cariotipo tradicional ou para diagnosticos especificos mas estamos numa fase de alta produtividade na area de pesquisa identificando novos rearranjos de segmentos de DNA que codificam proteinas ou sao apenas reguladores.

O princípio básico do método é que a fita única de DNA vai se unir à sequência de seu DNA complementar. Assim, uma sonda de DNA para uma região específica de um cromossomo reconhece e hibrida com sua sequência complementar em um cromossomo metafásico ou dentro de um núcleo interfásico. Ambos têm que estar em conformação de fita única, então a sonda de DNA e o DNA designado devem ser desnaturados, geralmente aquecendo em um solução com formamida

Três tipos diferentes de sondas são tipicamente usados em estudos clínicos aplicando a técnica de FISH: 1.Sondas que reconhecem e se ligam a estruturas cromossômicas específicas constituídas de sequências de DNA repetitivo, como o que existem nos centromeros (de DNA alfa satélite) ou sequências telomericas. Dentro da sequência repitida há padrões de nucleotideos específicos para cada cromossomo. Atualmente há sondas centroméricas comerciais disponíveis que permitem identificar a maioria dos cromossomos homologos. Semelhantemente, há sondas que reconhecem telomeros dos braços longos e currtos de muitos dos homologos. A maioria das sondas alfa satélite centromericas mostram um sinal grande, luminoso e é útil tanto para identificação de cromossomos em metafase como em preparações de núcleos de interfásicos. As sondas teloméricas podem ser usadas, para a detecção de translocações crípticas, e para definir deleções intersticiais e terminais. 2.Sondas de sequências únicas hibridizam com DNA de cópia única em regiões específicas de um cromossomo ou gene. Na citogenética clínica estas sondas são normalmente chamadas de cosmideos. Estas sondas identificam regiões críticas de cromossomos que estào associadas a síndromes de microdeleções. Em cromossomos metafásicos, elas hibridizam com ambas as cromatides e normalmente mostram dois sinais pequeno e discretos por cromossomo. 3.Sondas que “pintam””cromossomos inteiros, também chamadas de “bibliotecas” são coquetéis de sondas de sequências únicas que reconhecem as sequências únicas de cromossomos específicos. Na metafase, ambos cromossomos homólogos são “pintados" e apresentam uma fluorescência brilhante. Entre outras aplicações, são usadas para definir a origem de segmentos cromossomicos em translocações ou marcadores supernumerários

Cada sonda é um segmento do genoma clonado em um vetor. Sao moleculas de DNA provenientes de virus ou bactérias nos quais um segmento de DNA pode ser inserido sem que o vetor perca a capacidade de auto replicação.

microdissecção feita com micromanipulador e agulhas de vidro – Antes da microdissecção as metáfases são saturadas com água. Os segmentos cromossômicos são dissolvidos com uma solução de proteinase K, amplificados usando uma reação de PCR com oligonucleotídeos degenerados (DOP-PCR) e marcados com fluorocromos.

Quando células de roedores e de seres humanos se fundem, os cromossomos humanos são preferencialmente expelidos mas alguns são retidos. Usando diferentes linhagens celulares mutantes e diferentes meios, foram preparados painéis de células híbridas e cada painel contem um cromossomo humano ou um grupo de cromossomos humanos. Como esses cromossomos podem ser identificados ao microscópio óptico essas células híbridas podem ser utilizadas para mapear genes em cromossomos específicos através de Hibridação e clonagem ou para produzir sondas através de um cell sorter.

Cell sorter citômetro -> produção de bibliotecas – Neste processo os cromossomos são corados com dois corantes que se ligam nos segmentos ricos em A-T e C-G, respectivamente. Rompe-se as membranas celulares e os cromossomos ficam livre numa suspensão líquida. Essa suspensão é convertida em spray de forma que cada gota do spray tem um cromossomo. O spray passa por raios laser que excitam a fluorescência. Cada cromossomo produz um sinal fluorescente característico, que é reconhecido eletronicamente e duas placas defletoras dirigem as gotas com os cromossomos para seu respectivo tubo coletor.

A escolha dos vetores e sondas estáo relacionados ao problema que queremos esclarecer. Enquanto os YACs permitem a clonagem de segmentos grandes de DNA os oligos sint[eticos podem ter apenas 20 a 25 nucleotideos.

A nomenclatura cromossômica para a técnica de FISH deve indicar a sonda utilizada, o cromossomo e banda onde esta está localizada e o número de cópias observado. Se for realizada a citogenética convencional, esta deve ser colocada em primeiro lugar seguida por um ponto (.) e a nomenclatura resultante do FISH indicada pela abreviatura ish, um espaço e o resultado da hibridação. Assim, o cariótipo 46,XX.ish 22q11.2(D22S75X2) indica que a sonda D22S75 (localizada em 22q11.2 na região responsável pela síndrome de DiGeorge) apresenta hibridação normal com os dois cromossomos 22 enquanto que o cariótipo 46,XX.ish del(22)(q11.2q11.2)(D22S75-) indica uma deleção da região correspondente à sonda D22S75 só detectada pela técnica de FISH. A nomenclatura das sondas também segue normas internacionais e específicas para cada tipo. Por exemplo, a sonda de seqüência centromérica D15Z4 indica sonda do DNA satélite do centrômero do 15, a sonda de seqüência única SRY indica gene SRY do cromossomo Y e a sonda wcp17 indica sonda de pintura cromossômica do 17. Em núcleos interfásicos os resultados de FISH são precedidos por nuc ish e seguidos pelo número de sinais das sondas utilizadas. Assim, nuc ish(DXZ1 X 3) indica hibridação em núcleo interfásico com três cópias do locus DXZ1, correspondente à região centromérica do cromossomo

fiber-fish –é uma técnica na qual as sondas são aplicadas em cromossomos que foram mecanicamente (ou quimicamente com o uso de detergentes) esticados. O que se ve como um ponto na resolução normal do microscópio aparece como uma linha. Foi bastante usada para mapeamento genico e foram diagnosticados microrearranjos que elucidaram a estrutura e origem de alterações cromossômicas. Náo e uma tecnica usada na pratica clinica.

m-fish/sky - Uma das vantagens do FISH é a possibilidade de se usar mais de uma sonda marcada com cor diferente ao mesmo tempo. Os fluorocromos podem também ser usados em conjunto, fornecendo uma terceira cor. Por exemplo, se uma sonda é marcada em verde (FITC) outra em vermelho (Rodamina), uma terceira sonda pode ser marcada com ambos fluorocromos, resultando numa cor amarela. Assim, com o uso de três fluoroforos diferentes, teremos 7 cores e assim por diante. Esse é o príncipio no qual se baseia o M-FISH. Os cromossomos são hibridados com bibliotecas coradas com uma combinação de 5 fluoróforos. Após a hibridação, as 5 imagens são capturadas com uma câmera digital e combinação e superposição de imagens permite a identificação dos 23 pares cromossômicos. É claro que cada fluoroforo necessita de um filtro específico para ser visualizado.

SKY- spectral karyotyping foi introduzida em 1996 por Schrok et al . coloca todos os cromossomos em uma só imagem, usando as qualidades da luz combina duas tecnologias: a captura de imagem por uma câmara de vídeo (CCD) e a espectrometria. A câmara produz uma imagem monocromática e a espectrometria mede o spectro de áreas selecionadas do objeto e coloca cada espectro em um gráfico separado. A luz emitida passa por um filtro triplo e depois por um interferômetro, é capturadaa por uma câmara CCD e é gerado um interferograma. O espectro medido é recuperado. Sky usa uma combinação de paiting probes com 1-4 fluoróforos por cromossomo. O que distingue SKY de M-FISH é a aquisição da imagem e o programa de análise. SKY usa apenas um filtro (triplo) e todos os corantes são excitados e medidos simultaneamente. Depois que a luz emitida pelas painting probes passa pelo filtro é mandada através de um interferômetro que cria caminhos ópticos diferentes, dependendo da combinação dos fluorocromos. As imagens são então capturadas por uma câmara de CCD. Num tempo de exposição de cerca de 2 minutos, a câmara capta aproximadamente 100 quadros da mesma imagem e mede simultaneamente a intensidade de cada pixel da imagem em diferentes comprimentos de ondas. Depois que a imagem é adquirida, gera-se um interferograma para cada pixel. Desse interferograma a emissão do espectro é recuperada por transformação Fourrier. Para ver a imagem colorida, o espectro medido de cada pixel é dividido em 3 faixas de ondas (475 a 550nm em azul, 550 a 650 nm em verde e 650 a 750 nm em vermelho. A intensidade de cada cor é proporcional a intensidade integrada da faixa espectral correspondente. As cores observadas são semelhantes às obtidas pela técnica de FISH. Nesse estágio não se distinguem os diferentes cromossomos, mas é um estágio importante para se avaliar a uniformidade do sinal na metáfase inteira. No próximo passo, a classificação das cores, é baseado na medida de cada pixel. Algoritmos produzem uma imagem na qual todos os pixels com o mesmo espectro são colocados na mesma cor. Esse algoritmo é baseado no espectro de referência arquivado no computador e automaticamente identifica todos os pixels na imagem

comparação de genomas Detecta diferenças na quantidade de cópias de DNA entre a amostra a ser testada e uma amostra controle O DNA teste é marcado com um fluorocromo vermelho e o normal com um fluorocromo verde.As duas amostras são misturadas e hibridadas em uma lâmina que contém metáfases normais. Após hibridação e coloração com DAPI (azul), um softer calcula a razão entre as diferentes emissões de fluorescência verde e vermelha. Os segmentos de DNA amplificados serão mais verdes e segmentos deficientes serão mais vermelhos. Permite o estudo de amostras antigas, arquivadas em parafina. Não é necessário se ter metáfase da amostra de interesse, apenas DNA. (Pinkel, 1998) Variação na dosagem gênica ocorre em diversas condições patológicas. Em cancer, deleções e amplificações gênicas implicam em alterações na expressão de genes supressores de tumor e oncogenes, respectivemente. Anomalias de desenvolvimento como S. de Down, Cri du chat, Di George resultam de ganho ou perda de segmentos cromossômicos. Assim a detecção e o mapeamento desses segmentos adiconais ou ausentes fornecem uma estratégia para a associação da alteração com a doença e localização de genes críticos. A técnica de CGH(hibridação genômica comparativa) foi desenvolvida para permitir a detecção de desequilíbrio genômico em um único experimento (Kaliomeni). Nessa técnica, DNA genômico de uma população de células teste e DNA Genômico normal (referencia) são marcados com fluorocromos de cores diferentes e co-hibridizados em uma lâmina que contem metáfases normais. Utiliza-se também uma substância que supreme os sinais de sequencias repetitivas Cot-1[ver detalhes]. A proporção entre as intensidades de fluorescência nos cromossomos metafásicos é proporcional à quantidade de cópias do DNA teste e do DNA referência. CGH tem sido utilizada principalmente para estudos de neoplasias tanto humanas como em camundongos

Entretanto há um limite para o nivel de detecção (tamanho) de segmentos amplificados ou deletados, em função do uso de metáfases (~20Mb). Essa resolução é semelhante à detectada por banda G..

Considerando essas limitações, Pinkel et al (1998) propuseram uma técnica que utilizaria uma lâmina com uma série de sequências mapeadas ao invés de cromossomos inteiros. (ref. 6 salinas – Toldo, 1997) O número de cópias estaria associado a razão das intensidades de fluorescência dos DNAs teste e referência e a resolução seria determinada pela distância entre as sequências colocadas na lâmina No trabalho em que esses autores descreveram essa técnica utilizaram segmentos do cromossomo 20 a uma distância de ~3Mb entre si e quatro clones no cromossomo X.Aplicaram a linhagens celulares de cancer de mama com amplficações e deleções previamente descritas. Comparando os achados verificaram que a técnica possibilitava identificar ganhos e perdas de segmentos cromossômicos de aproximadamente 40kb.

Na técnica de array-CGH, a hibridação é realizada em uma lâmina contendo milhares de seqüências de DNA arranjadas em fileiras (arrays) em uma determinada ordem, ao invés da lâmina com cromossomos (Figura 6b). Esses arrays são construídos a partir de clones de cromossomos artificiais de bactérias (BACs) ou oligonucleotídeos e aumentam a sensibilidade da detecção de perdas ou ganhos de segmentos cromossômicos, equivalendo a milhares de experimentos de FISH em uma só reação. A resolução depende do tipo de array utilizado e da densidade e posição das seqüências de DNA. Estima-se que a resolução da CGH convencional seja de 3 a 6 Mb enquanto que as plataformas de array-CGH permitem um nível maior de resolução. A resolução com BACs é de cerca de 100 kb a 1 Mb enquanto que a resolução com oligonuceotídeos pode ser de até 100 kb e, teoricamente, de até 6 kb.

A aplicação da técnica de array CGH no diagnóstico clínico tem mostrado as limitações da análise citogenética clássica com banda G. Ela já está sendo usada há 4-5 anos com plataformas que incluem segmentos relativamente grandes (1Mb) Esta tecnologia já está mudando para plataformas que utilizam oligonucleotídos isotermicos grandes. Ex.: Agilent, Nimblegen and Combimatrix Esses arrays tem a vantagem de ter milhares de sondas em uma única lâmina, resultando na análise de desequilíbrios genômicos num nível de resolução jamais alcançado até agora. Algumas plataformas como as da Affymetrix e Illumina fornecem, além da variação do número de cópias, também informações sobre dissomia uniparental pela forma de perda de heterozigosidade. (for example, refs. 17,38).

Estas informações levarão à identifição de novas sindromes e a compreensão das complexas interações bioquímico-moleculares. Para sabermos até que ponto essas variações nos números de cópias são responsáveis pelas alterações fenotípicas ou até que ponto elas são responsáveis por variações fenotípicas (penetrância e expressão variada); até que ponto são responsáveis por predisposições às doenças comuns serão necessários alguns anos de pesquisas, mas, não há dúvida que essa metodologia será utilizada em breve nos laboratórios para diagnóstico.

Chegamos numa fase em que os métodos citogenéticos encontram-se com os métodos utilizados pela genética molecular, que na literatura já foi chamado de “citogenômica”. Em uma extremidade temos os métodos que detectam variações em um único nucleotídeo. Na outra extremidade temos a detecção de cromossomos inteiros. A combinação apropriada dessas metodologias levará a resposta apropriada às nossas perguntas na área de pesquisa. Na prática clínica devem ser escolhidas as metodologias que resultam em melhor custo-benefício. Se por um lado a execução dessas técnicas deverá ser cada vez mais simples, será cada vez mais complexa a atuação do clinico e do laboratório na indicação de qual o melhor teste para obter o melhor resultado, isto é, aquele que dará a resposta para a conduta mais adequada.

CITOGENÉTICA MOLECULAR EPM 2009 CLEIDE LARGMAN BOROVIK

CITOGENÉTICA HUMANA PESQUISA BÁSICA DIAGNÓSTICO CLÍNICO Técnicas laboratoriais Evolução do mapeamento gênico e repercussões clínicas

Gartler Nature Reviews Genetics 7, 655–660 (August 2006) | doi:10.1038/nrg1917 Tjio, J. H. & Levan, A. The chromosome number of man. Hereditas 42, 1–6 (1956)

NASCE A CITOGENÉTICA CLÍNICA DÉCADA DAS TRISSOMIAS ESTUDOS POPULACIONAIS RECÉM-NASCIDOS CONSECUTIVOS POPULAÇÕES SELECIONADAS RETARDO MENTAL ATRASO NO DESENVOLVIMENTO ESTERILIDADE – INFERTILIDADE DISTÚRBIOS DE COMPORTAMENTO ANOS 60

ANOS 70 TÉCNICAS DE BANDAS BANDA Q BANDA G BANDA R

AN0S 80 - ALTA RESOLUÇÃO Yunis, JJ - High resolution of human chromosomes Science 26 March 1976: 1268-1270

MICRODELEÇÕES - SÍNDROMES DOS GENES CONTÍGUOS

Uso de sondas radioativas de sequências altamente repetitivas de DNA hibridando com regiões centroméricas de cromossomos de camundongo. HIBRIDAÇÃO IN SITU PRIMÓRDIOS

1990--------------------------------------------------------------------------------------2009 FISH – SKY – M-FISH – R-FISH - FIBER FISH – CGH – ARRAY-CGH CITOGENÉTICA MOLECULAR TÉCNICAS RESPOSTAS ------------------------------------------------------ NOVAS QUESTÕES

CITOGENÉTICA MOLECULAR TÉCNICAS POSSIBILIDADES E LIMITES DE CADA PROCEDIMENTO SOLICITAÇÃO DE EXAMES INTERPRETAÇÃO DOS LAUDOS ETC.

CITOGENÉTICA MOLECULAR CLÍNICA x PESQUISA IDENTIFICAR E LOCALIZAR GENES, REARRANJOS GÊNICOS OU OUTROS REARRANJOS DE SEGMENTOS DE DNA, CODIFICANTES OU NÃO, E SUAS FUNÇÕES COMPLEMENTAR O DIAGNÓSTICO DE ANOMALIAS CROMOSSÔMICAS IDENTIFICAR MICROREARRANJOS E AUXILIAR O ACONSELHAMENTO GENÉTICO OU A CONDUTA TERAPÊUTICA DIAGNÓSTICOS ESPECIFICOS

Fluorescent In Situ Hybridization INÍCIO DA NOVA CITOGENÉTICA

FISH (hibridação in situ fluorescente) Técnica que permite que um segmento de DNA marcado (sonda) se acople diretamente com a seqüência homóloga do DNA de uma célula, possibilitando sua visualização em lâminas para microscopia.

FISH TIPOS DE SONDAS BIBLIOTECAS OU PINTURAS CENTROMÉRICAS LOCUS ESPECÍFICAS CROMOSSOMOS ESPECÍFICOS 1-22, X-Y GENES ESPECÍFICOS TELOMÉRICAS

PRODUÇÃO DE SONDAS COSMÍDEOS, PLASMIDEOS, BACS, YACS,– Cromossomos artificiais - vetores utilizados para clonar segmentos de DNA - Bacterial Artificial Chromosome -Yeast Artificial Chromosome MICRODISSECÇÃO HIBRIDAÇÃO DE CÉLULAS SOMÁTICAS CELL SORTER (Separador de celulas) OLIGONUCLEOTÍDEOS SINTÉTICOS

MICRODISSECÇÃO Micromanipulador e agulhas de vidro Segmentos cromossômicos dissolvidos com enzimas, submetidos a amplificação por DOP-PCR e marcados com fluorocromos Engelen et al. J Med Genet, 1998; 35:265-268

HÍBRIDOS DE CÉLULA SOMÁTICAS Fusão de células na presença de viroses ou polietileno glicol Meios de cultura deficientes em substâncias essenciais para o roedor

CELL SORTER

FISH SONDAS e VETORES Tamanho YACs – levedura (yeast) – 200 a 500 kb BACs – bactérias – até 300kb PACs – bacteriófagos - 130 a 150 kb Plasmídeos e Cosmídeos – ~ 40kb oligos sintéticos – 20 a 25 nucleotídeos

FISH - PREPARAÇÃO

PREPARAÇÃO - FISH

FISH no Laboratório Clínico Sondas comerciais -Diagnóstico pré-implantacional Diagnóstico pré-natal Diagnóstico pós-natal: Identificação de marcadores Identificação de microdeleções Identificação de translocações Pesquisa de mosaicismo Diagnósticos em Oncologia e Oncohematologia Avaliação de doença residual Avaliação de amplificação gênica Vysis – Abbott molecular Cytocell Q biogen Cambio Kreatech – Poseidon - Uniscience

AMOSTRAS CROMOSSOMOS NÚCLEOS INTERFÁSICOS CÉLULAS FRESCAS CÉLULAS FIXADAS SANGUE MEDULA ÓSSEA FIBROBLASTOS AMNIÓCITOS BLOCOS DE PARAFINA ETC.

IDENTIFICAÇÃO SIMULTÂNEA Preparações diretas de amniócitos a)com sonda 13/21 (Vysis) mostrando 3 cópias do cromossomo 21 e 2 cópias do cromossomo 13 b) com sonda X/Y/18 (Vysis) mostrando 3 cópias do cromossomo 18, um X e um Y a a b 21 21 21 13 13 18 18 18 X Y

IDENTIFICAÇÃO DE TRISSOMIAS CÉLULAS INTERFÁSICAS TRISSOMIA 8 Sonda centromérica

IDENTIFICAÇÃO DE QUIMERAS/TRISSOMIAS QUANTIFICAÇÃO

IDENTIFICAÇÃO DE QUIMERAS QUANTIFICAÇÃO TMO XX/XY

IDENTIFICAÇÃO DE TRISSOMIAS CÉLULAS INTERFÁSICAS SONDA LOCUS ESPECÍFICA 13(q14)

PESQUISA DE MOSAICISMO EM DIVERSOS TECIDOS CEP 12 em mucosa oral Síndrome de Pallister-Killian

IDENTIFICAÇÃO DE MARCADORES Mar = dic(Y)

IDENTIFICAÇÃO DE MARCADORES

IDENTIFICAÇÃO DE MARCADORES Multiprobe (Cytocell)

MICRODELEÇÕES - SÍNDROMES DOS GENES CONTÍGUOS

IDENTIFICAÇÃO DE MICRODELEÇÕES S. DiGEORGE del(22q11.2)

IDENTIFICAÇÃO DE MICRODELEÇÕES S. de William’s del(7q11.2)

IDENTIFICAÇÃO DE MICRODELEÇÕES Cri-du-chat del(5p15)

IDENTIFICAÇÃO DE TRANSLOCAÇÕES t(Y;18)

17 der(5) 46,XX,t(5;17)(p15.1;q12-q21) q21 der(17) 5p15 der( ) 17q21 sonda 5p15(G) 5q34(R) Sonda RARa /PML 17q21/15q22 15

IDENTIFICAÇÃO DE TRANSLOCAÇÕES E PONTOS DE QUEBRA 46,XY,t(2;18)(q22;q23) 18 der(2) der(18)

IDENTIFICAÇÃO DE PONTOS DE QUEBRA

IDENTIFICAÇÃO DE PONTOS DE QUEBRA

DELEÇÕES SUB-TELOMÉRICAS

FISH - TELOMEROS

NOMENCLATURA SONDA UTILIZADA CROMOSSOMO BANDA RESULTADO DE CITOGENÉTICA CONVENCIONAL Ex.: 46,XX.ish 22q11.2(D22S75 X 2) – sonda D22S75 localizada no braço longo do cromossomo 22, banda 11.2 aparece nos dois cromossomos, portanto NORMAL 46,XX.ish del(22)(q11.2q11.2)(D22S75-) ->deleção em um dos cromossomos 22 só ídentificado por FISH

CONTROLE DE QUALIDADE Validação da sonda Sensibilidade especificidade Validação do teste Controles normais

ESPECIFICIDADE Four products are offered targeting abnormalities involving 15q11-q13. Vysis 15q11-q13 probes are premixed with a CEP 15 control probe. The SNRPN and D15S10 probe mixes also include LSI PML (15q22), a probe targeting translocations in AS and PWS.

FIBER-FISH FiberFISH results showing telomere-specific probe signals in green and (TTAGGG)n probe signals in red. A, Control hybridization showing 4p cosmid (B31: ~33 kb insert) ~80 kb from the (TTAGGG)n repeat sequence. B, control hybridization showing 16p cosmid (cGG4: ~36 kb insert) ~100 kb from the (TTAGGG)n repeat. C, test hybridization showing 7p PAC (164-D18) ~130 kb from the (TTAGGG)n repeat. Knight et al, 2000 telomero controle

M-FISH . Uso de “bibliotecas” coradas com uma combinação de 5 fluoróforos. Captura de 5 imagens com 5 diferentes filtros Combinação e superposição de imagens Identificação dos 23 pares cromossômicos

SKY Uso de “bibliotecas” coradas com uma combinação de 5 fluoróforos. Uso de apenas um filtro (triplo) Todos os corantes são excitados e medidos simultaneamente e a imagem passa por um interferômetro.

Copyright ©2003 AlphaMed Press Varella-Garcia, M. Oncologist 2003;8:45-58 Figure 6. Images captured for the M-FISH karyotyping analysis: DAPI (counterstain) alone and combined with SpectrumAquaTM, SpectrumGreenTM, SpectrumGoldTM, SpectrumRedTM, and SpectrumFarRedTM

Copyright ©2003 AlphaMed Press Varella-Garcia, M. Oncologist 2003;8:45-58 Figure 5. Spectral karyotype of a cell representative of the small cell lung carcinoma cell line UMC19

Martelli e Vergner Caracterização citogenética molecular de cromossomos marcadores extranumerários Laus, Ana Carolina http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-06042009-143340/ 08/04/2009

Comparative Genomic Hybridization Célula tumoral Célula normal DNA extraído e marcado Mistura DNA do tumor e normal Hibrida em lâmina com metáfases normais

Copyright ©2003 AlphaMed Press Varella-Garcia, M. Oncologist 2003;8:45-58 Figure 3. Searching for genomic imbalances using CGH

0 Comparative Genomic Hybridization

CGH

CGH

CGH VANTAGENS E LIMITAÇÕES Vantagens Usa DNA Não necessita metáfases Identifica desequilíbrios de segmentos cromossômicos no complemento genômico completo Limitações Baixa resolução (<10 Mb) Não detecta rearranjos equilibrados Qualidade das metáfases e morfologia dos cromossomos é fundamental

CGH ARRAYS - PRIMÓRDIOS SOLINAS-TOLDO 1997 PINKEL, 1998

ARRAYS GENÔMICOS METODOLOGIA Amostra Referência Amostra Teste Verde Vermelho Mistura com Cot-1 DNA e hibridiza no “chip” Lave e escaneia Extração de DNA Marcação dos DNAs genômicos Co-hybridização Coloração com DAPI Análise da Imagem

ARRAY-CGH NO LABORATÓRIO CLÍNICO CENTRO DE ESTUDO DO GENOMA (Dra. Carla Rosenberg)

3500 BAC/PAC – em intervalos de 1Mb

OLIGO-ARRAYS Menor custo na fabricação Nível de resolução maior Informação sobre o número de cópias de DNA Perda de heterozigosidade

NOVAS SINDROMES 2006, v 38(9)

VALIDAÇÃO Koolen et al, 2006

Decipher, 5th may,2009 DECIPHER - DatabasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources http://decipher.sanger.ac.uk/ All patients – 2222 Consented – 1084 Syndromes – 58 Array types – 42 Studies – 141

PATIENTS

Compreensão das interações bioquímico-moleculares Identificação de novas síndromes? Influência das CNVs (variações do número de cópias) na variação fenotípica, penetrância e expressividade Influência na predisposição às doenças comuns? Influência das CNVs na resposta às drogas? USO NO DIAGNÓSTICO CLÍNICO?

All these progresses have set the stage for a golden era of combined microscopic and sub-microscopic (cytogenomic)-based research of chromosomes leading to a more complete understanding of the human genome. Feuk et al, 2006 CITOGENÔMICA

HISTÓRIA 1956 Tjio e Levan Ford e Hamerton TEMOS 46 CROMOSSOMOS! 1960 S. de Down e outras trissomias 1970 Casperson Banda Q 1970-1980 banda G, C, R, alta resolução 1970-1980 inúmeras alterações cromossômicas 1990-2000 FISH, SKY CGH Mapeamento gênico CIÊNCIA BÁSICA DIAGNÓSTICO CLÍNICO ARRAY-CGH Sindromes dos genes contíguos Microdeleções del Teloméricas CNV OLIGO-ARRAY Harper et al, 1981- hibridação in situ

cleide.borovik@gmail.com hereditas07@gmail.com