Técnicas básicas de biología molecular PCR, clonaje y secuenciación

Watson & Crick (1953) Rosalind Franklin (1921-1958)

PCR, clonaje y secuenciación Muestra 1. Extracción ADN 2. Amplificación (PCR) 3. Clonaje 4. Secuenciación ATGCTGA

Kits comerciales CTAB, cloroformo-etanol Rotura previa de las células

Extracción ADN: Kits comerciales Tiempo : <30 mins

Extracción ADN: Método CTAB Tiempo : 2hrs 1/2 Reactivos: CTAB Tampón de extracción Composición (para 100 mL): Tris HCl: 15.76 gr CTAB: 3 gr NaCl: 8.18 gr EDTA: 0.534 gr Ajustar a pH = 8 Cloroformo-isoamyl alcohol (24:1) Isopropanol 80% etanol

2/4 Polymerase Chain Reaction (PCR) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método de síntesis in vitro de ADN. Existen diferentes tipos de enzimas polimerasa (de ADN y ARN). Taq ADN polimerasa (Termus aquaticus) En células eucariotas tenemos 4 clases de ADN polimerasas (A,B,X,Y) y dentro de cada clase diferentes variedades (a,b,d,e…hasta 13 diferentes; Burgers et al 2001). Se distinguen por su localización (nuclear, mitocondrial, plastidal) y función (síntesis hebra adelantada, retrasada, reparación ADN, etc…) Bacteria G-, aislada en el Parque Nacional de Yellowstone (EEUU). Son termófilas y sus enzimas de gran utilidad para diversas aplicaciones: papel, biocombustibles y…PCR (Kary Mullis, 1983).

El proceso de la PCR depende de la complementariedad de las bases (nucleótidos) en la doble hélice de ADN. Al calentar el ADN se obtienen cadenas sencillas. Al enfriarlo las bases se vuelven a unir en la doble hélice original. Para que la PCR tenga lugar son necesarios los cebadores (“primers”) adaptados al extremo 3’ del fragmento de interés. 5’ TAGCACGTAGCT ACGTTTACGTCAATGCA TGCACCTACAATG 3’ 3’ ATCGTGCATCGA TGCAAATGCAGTTACGT ACGTGGATGTTAC 5’ FORWARD 5’ TAGCACGTAGCT 3’ REVERSE 3’ ACGTGGATGTTAC 5’ REVERSE 5’ CATTGTAGGTGCA 3’ 2/4 (PCR)

La Taq ADN polimerasa lee en dirección 3’-5’ y sintetiza una nueva cadena complementaria en la dirección 5’-3’, usando di-deoxy- nucleósido trifosfatos (dNTP’s = nucleótidos A,C,T,G). 5’ TAGCACGTAGCT ACGTTTACGTCAATGCA TGCACCTACAATG 3’ 3’ ATCGTGCATCGA TGCAAATGCAGTTACGT ACGTGGATGTTAC 5’ 5’ TAGCACGTAGCT 3’ 3’ ACGTGGATGTTAC 5’ ACGTTTACGTCAATGCA TGCACCTACAATG ATCGTGCATCGA TGCAAATGCAGTTACGT En la mezcla de reacción se añade Mg2+ (MgCl2) como cofactor para la Taq, un tampón apropiado y H20 estéril.

PCR

Etapas PCR Desnaturalización. Se calienta ADN a 94°C la doble hélice se separa. Ligamiento. La mezcla se enfría (entre 50-60 °C) para permitir la hibridación de los cebadores. Extensión. La mezcla se calienta a 72 °C. En la presencia de Taq ADN polimerasa, tampón PCR, dNTP’s y Mg2+ se produce la replicación del ADN. Temperatura Ciclo 1 Ciclo 3 Ciclo 2 Ciclo 4

PCR

El ADN tiene carga negativa y migrará hacia el polo positivo. Revelado: electroforesis

3/4 Clonaje VECTOR: resistencia a antibióticos y discriminación de colonias Productos PCR 18S rDNA Librería de clones 12-15 hrs después…

Los plásmidos son fragmentos extracromosómicos de ADN o ARN que aparecen en el citoplasma de procariotas. Vector TA, UA Resistencia a ampicilina. Identificación de colonias gracias al operón lac. Puntos de corte para múltiples enzimas de restricción.

La bacteria E. coli puede metabolizar lactosa, pero necesita expresar enzimas, codificadas por el operon lac: consta de 3 genes estructurales (lacZ, lacY, y lacA) lacZ -> β-galactosidasa (lactosa a galactosa y glucosa). La expresión de estos genes origina un mRNA y la RNA polimerasa inicia la transcripción. La secuencia “operador”, contigua a la “promotora”, regula la transcripción. Una proteína represora, codificada por el gen regulador lacI se une o no al “operador” en función de los niveles de lactosa. La alolactosa se une a la proteína represora, impide su unión al operador y posibilita que la RNA polimerasa transcriba los genes para metabolizar lactosa. Operón lac E. coli modificada no tiene operón lac Ausencia de lactosa = represor activo En presencia de lactosa = represor inactivado

IPTG (isopropyltiogalactósido). alolactosa lactosa X-Gal (5-bromo-4-choro-3-indolil-b-D-galactopyranósido). INDUCTOR SUSTRATO Naturaleza Laboratorio El vector posee gen lacZ: Las bacterias con vector inalterado producen β-galactosidasa y degradan un sustrato artificial X-Gal dando una coloración AZUL Las colonias con producto PCR en el vector permanecen BLANCAS “cortocircuitan” gen lacZ y no hay degradación de X-Gal

Análisis librería clones (RFLP) Enzima de restricción Secuenciación clones diferentes PCR sobre colonias 18S rDNA HaeIII corta en… 5'...GG/CC...3' 3'...CC/GG...5'

Clon 1 Clon 1 Clon 2 Clon 3 Clon 4 Clon 5 4/4 Secuenciación

Reacción de Secuenciación x 30 ciclos 1. Desnaturalización 1 min 94ºC 2. Ligamiento 15 sg 50ºC 1 primer 3. Extensión 4 min 60ºC Mezcla dNTP’s y ddNTP’s ddNTP’s: Nucleótidos modificados fluorescentes

Productos PCR 1er ciclo 2º ciclo Cada vez que se incorporan ddNTP’s la elongación de cada fragmento se detiene …. 30 ciclos Fragmentos de diferente longitud

Electroforesis capilar

Análisis filogenético Secuencia 18S rDNA Clon 3

FIN