Gloria L. Camargo Laboratorio de Virología Universidad de Boyaca CULTIVOS CELULARES

Que son los cultivos celulares?... Conjunto de técnicas Mantenimiento o crecimiento Cell, tejidos u órganos (animal o vegetal) Cto, x.x, metabolismos Ambiente artificial in vitro Fisiológicas, bioquímicas, genéticas propiedades

APLICACIÓN... Aislamiento Amplificación Descubrimiento Vacunas Rta inmunitaria Hospedero Biología molecular Bioquímica

HISTORIA...

Consiste en transferir células de un cultivo crecido a un nuevo recipiente, para que se genere otro cultivo. (PASE) Extraer el órgano o tejido del organismo de origen Tienen diferentes clases de cultivo, que se caracteriza Capacidad de replicacion Capacidad de ser sub-cultivado CLASES DE CULTIVOS CELULARES...

CULTIVOS EN MONOCAPA... Células adherentes o cultivos fijos Requieren unirse SUPERFICIE Dependientes de anclaje MULTIPLICARSE 2 TIPOS AGITACIÓN ESTACIONARIO

CULTIVOS EN SUSPENSIÓN ... Células se multiplican Suspendidas Medio liquido Subcultivo por dilución No adhesión Cultivo inicial adquirió máximo de saturación

CULTIVO PRIMARIO... MÁXIMO 10 SUBCULTIVOS. Células provenientes del tejido original Trasplantados a Condiciones artificiales Porción celular variada POBLACIÓN CELULAR PASES SUCESIVOS PROLIFERAR LENTAMENTE RÁPIDAMENTE DESAPARECE PREDOMINA

LINEAS CELULARES... Derivadas de un cultivo primario, se pueden cultivar in vitro repetidamente y se dividen en : DIPLOIDE HETEROPLOIDES + 75% Mismo cariotipo de las células Se originan normales y siguen normales - 75% Mismo cariotipo de las células Se originan tejido normal o anormal Cell sufren transformaciones

LINEA CELULARES TEJIDO DE ORIGEN VIRUS QUE PUEDEN SER AISLADOS EN CADA TIPO CELULAR HEp-2 Carcinoma epidermoide de laringe humana Herpes simplex, Enterovirus, Poliovirus, Adenovirus. MDBK Riñón bovino Herpes y Adenovirus bovino, estomatitis vesicular. MDCK Riñón canino Influenza, Adenovirus MRC-5 Pulmón embrionario humano Citomegalovirus Vero Riñón de mono Herpes y Poliovirus BHK-21 Riñón de hamster Estomatitis vesicular y feibre aftosa HeLa Carcinoma de cervix humano Poliovis, Adenovurus RD Rhabdomiosarcoma humano Poliovirus, Herpes simplex PK 15 riñón porcino Estomatitis vesicular, Parvovirus porcino. A. albopictus Larva de Aedes albopictus Arbovirus.

MEDIOS DE CULTIVO... MEM Medio de crecimiento Medio de mantenimiento Medios selectivos Medios de congelación Requerimiento Mínimo MEM MEM Tipo de células MEM SSB, a.a. vitaminas 10-15% 2% SFB Propósito del cultivo 50% SFB Base para los demás medios SFB Intervalo de subcultivos Crecimiento utilización 8% dimetil sulfoxido

Factores basicos para la supervivencia celular... Presión osmótica pH CO2 Oxigeno Agua SSB Vitaminas A.A. Suero

Obtención de las células..

Unión a colorantes acoplados a colorantes fluorescentes

MICRODISEPCIÓN POR CAPTURA DE LASER

Contenedores para cultivo celular A: Fraso T. B: Frasco triple. C: Botellas rodantes. D: Biorreactor. E: Frasco con pipetas. F: Frascos con agitación.

Contaminación de los cultivos cell... La contaminación puede tener varios origenes: Tejidos originales Productos biológicos (suero –mycoplasma R a penicilina) El personal del laboratorio con su propia flora Del medio ambiente (laboratorio- material)

Cuando esta presente en cultivos celulares, no siempre resulta en alteraciones microscópicas de las células o del medio; muchas infecciones crecen lentamente y pueden tener los siguientes efectos:

Niveles y normas de seguridad Nivel 1. No presentan peligros reconocidos. Nivel 2. Se emplean materiales de origen primario que no se conoce el riesgo de infección o que tienen la posibilidad de que en las muestras contengan VIH, TBC, hepatitis B u otros patógenos. Nivel 3. Su manejo presenta un riesgo potencial. Nivel 4. Extremadamente peligrosos.

Contaje celular... Porcentaje de viabilidad (%) = Número de células vivas/Número de células totales *100 (>85-90% se siembra). Número de células vivas/ml = Células contadas vivas x factor de dilución x 104 Número de células necesarias = Número de placas x la mitad del volumen de cada placa x células viables (1.350.000 para neuronas).

Ventajas...

CULTIVO DE CELULAS INFECTADA CON SARAMPION 7 DIAS POST INOCULACIÓN SE OBSERVAN CÉLULAS GIGANTES Y MULTINUCLEADAS (40X)

SE OBSERVAN INCITOS (AGRUPACIONES DE CÉLULAS) EN 100X

CÉLULAS VERO SIN INFECTAR 48 HORAS POS INFECCION.

CÉLULAS VERO SIN INFECTAR, SE OBSERVA BIEN DEFINIDO EL CITOPLASMA, LOS NUCLEOS CON SUSU RESPECTIVOS NUCLEOLOS.

CÉLULAS VERO 24 HORAS POS INFECCION

CELULAS DE HIGADO DE CONEJO TEÑIDAS CON GIMSA , 48 HORAS POS INFECCION (100X) NORMALES.

CÉLULAS DE HIGADO DE CONEJO SIN INFECTAR, SE OBSERVAN LOS NUCLEOLOS Y CITOPLASMA SINAFECTAR.

CÉLULAS GIGANTES POR EFECTO CITOPATICO ( CULTIVO DE CELULAS DE CONEJO) CAUSADO POR VIRUS DE Herpes zoster.

CÉLULAS DE HIGADO DE CONEJO INFECTADAS con virus Herpes Zoster.

INFECTADA Vs NO INFECTADA

Gracias…